Forskningsprosjektet levosimendan − fra idé til produkt

Preparatomtale | Felleskatalogtekst | Sikkerhetsinformasjon

I 1988 var den opprinnelige hensikten med prosjektet å utvikle et trygt legemiddel med positiv inotrop virkning. Åpenbart er substansens sikkerhet nærmere knyttet til dets innvirkning på hjertet enn til dets vasodilaterende effekt. Derfor gransket vi først de allerede kjente substansene med positiv inotropi og deres virkningsmekanismer, og forsøkte å avgjøre hva som var feil med disse substansene.

Enkelte av substansene åpner kalsiumkanaler av L-typen, enten direkte eller indirekte gjennom fosforylering av kanalene. Til denne gruppen hører PDE-hemmere som milrinon. En annen gruppe substanser er de som åpner natriumkanaler, noe som senere gir positiv inotropi på en indirekte måte gjennom utskifting natrium/kalsium. Digitalisglykosider, som hemmer natrium/kalium-ATPase, gir positiv inotropi på en indirekte måte gjennom utskifting natrium/kalsium. Dessuten kan substanser som forlenger aksjonspotensialet gjennom å blokkere kaliumkanaler gi positiv inotropi. Dette var situasjonen i 1988, og den er stort sett den samme i dag. Et fellestrekk ved alle disse substansene er at de øker den intracellulære kalsiumbelastningen, noe som medfører en risiko for spontan frigjøring av kalsium fra det sarkoplasmatiske retikkelet med påfølgende arytmi.1

Vi bestemte oss derfor for å forkaste denne grunnleggende strategien og valgte en ny variant, som først ble foreslått av professorene Solaro fra Chicago og Ruegg fra Heidelberg2. Denne nye strategien var basert på kalsiumsensitisering av kontraktile proteiner. Det finnes flere proteiner i kardiomyocyttene som regulerer kontraksjonsprosessen. Den første oppgaven ble derfor å velge et målprotein blant disse.

Vi visste hvordan troponinkompleksets konformasjon endres når kalsium binder seg til troponin C. Det skjer da en tropomyosinforskyvning som gjør det mulig for myosinhodet å binde seg til aktin. Vi innså raskt at hvis vi kunne lette bindingen av kalsium til troponin C, ville vi få en bedre kontraksjonstrigger uten å øke mengden av intracellulært kalsium.

Men mekanismer for kalsiumsensitisering hadde en alvorlig ulempe: det ville kunne vanskeliggjøre relaksasjonen av hjertemuskelen.

La oss se på situasjonen i detalj ved å se på hva som skjer med det intracellulære kalsiumnivået over tid og prosessen kontraksjon-relaksasjon. En substans som øker mottakeligheten for kalsium hos troponin C har sin proporsjonalt største virkning når kalsiumkonsentrasjonen i cytoplasma er lav og det ikke har bundet seg kalsium til troponin C. En slik substans er altså mest viktig, i den fasen der kalsiumnivået er på vei oppover, og dessverre også, når det er tid for relaksasjon. Vårt resonnement førte oss til tanken på å utvikle en substans som skulle oppføre seg motsatt i forhold til midlene som øker affiniteten for kalsium hos troponin C. Substansen burde med andre ord ha best virkning på det tidspunktet der det intracellulære kalsiumnivået er på sitt høyeste.

Vi bestemte oss altså for å utvikle en substans der bindingen til troponin C er kalsiumavhengig.

Når kalsium binder seg til den N-terminale delen i troponin C, åpner proteinet en hydrofob lomme. En substans burde kunne binde seg til denne lommen og stabilisere den kalsiuminduserte konformasjonsendringen hos troponin C. Dette ville da kunne være en mekanisme for kalsiumsensitisering av kontraktile proteiner.

Den neste oppgaven var å utvikle en sorteringsmetode som bygger på denne tanken.

Vi fikk ideen om at vi kunne binde troponin C i en kromatografisøyle og kjøre substansene gjennom søylen i henholdsvis en kalsiumfri oppløsning og en oppløsning med kalsium.

En substans som blir værende lenger i kalsiumløsningen enn i den kalsiumfrie oppløsningen har kalsiumavhengig binding til troponin C. Retensjonstiden for levosimendan var nesten dobbelt så lang i en oppløsning med kalsium som i en oppløsning uten kalsium3.

Nå hadde vi altså funnet molekyler med kalsiumavhengig binding til troponin C, men vi trengte også å vise at bindingsstedet var den aktuelle hydrofobe lommen, ettersom det var bare denne typen binding som ville stabilisere konformasjonen hos troponin C.

Vi detaljstuderte derfor bindingen av levosimendan til den N-terminale delen hos troponin C, ved hjelp av NMR. Det viste seg at levosimendan interagerte med aminosyregruppene i den hydrofobe lommen, og at det aktuelle bindingsstedet altså var det riktige4.

Vi trengte deretter å vise at binding av levosimendan til dette bindingsstedet virkelig ville stabilisere konformasjonen av troponin C. Vi merket derfor troponin C med dansylklorid, slik at det oppsto fluorescens når kalsium fremkalte en konformasjonsendring hos troponin C. Levosimendan forskjøv den kalsiuminduserte fluorescenskurven mot venstre, noe som tydet på at substansen stabiliserer den kalsiuminduserte konformasjonsendringen hos troponin C. Når troponin C som hadde gjennomgått punktmutasjon ble brukt i et liknende forsøk, hadde levosimendan mistet sin virkning, noe som viser at den polære aminosyren asparaginsyre i posisjon 88 i den ellers hydrofobe lommen var nødvendig for at levosimendan skulle binde seg til troponin C4.

Deretter forsøkte vi å påvise kalsiumsensitisering ved hjelp av levosimendan i avskallede fibrer fra papillærmuskulatur hos marsvin. Etter tilsetning av levosimendan til oppløsningen økte den kontraktile kraften påtagelig. Levosimendan fungerer som kalsiumsensitiserer også i sur (pH 6,7) oppløsning5. Sammenlignet med andre kalsiumsensitiserende substanser var levosimendan klart mest effektivt. EMD 57033 var også effektivt, med sin innvirkning på aktin-myosinkomplekset, mens pimobendan og MCI-154 var nesten uten effekt på disse fibrene.

Energiforbruket hos kontraktile proteiner økte ikke etter tilsetning av levosimendan ettersom levosimendan ikke økte aktiviteten hos ATPase, selv ikke ved høye konsentrasjoner.

Nå hadde vi altså for det første påvist at bindingen av levosimendan til troponin C var kalsiumavhengig, for det andre at bindingen av levosimendan skjedde til den hydrofobe lommen i det N-terminale domenet av troponin C, for det tredje at bindingen til den hydrofobe lommen stabiliserte den kalsiuminduserte konformasjonen hos troponin C, og for det fjerde at denne stabiliseringen innebar kalsiumsensitisering hos avskallede fibrer.

Deretter ville vi gjerne se hvordan relaksasjonstiden ble påvirket av levosimendan. Vi vurderte kontraksjon/relaksasjon opp mot tid i stimulerte papillærmuskler fra marsvin, for tydelig å kunne avlese effekten av levosimendan på relaksasjonen. Som forventet forsinker ikke levosimendan relaksasjonen.

Lancaster og Cook viste at levosimendan ikke øker den intracellulære kalsiumbelastningen i intakte kardiomyocytter, gjennom måling av intracellulære kalsiumnivåer parallelt med kontraktilitet (5). Tilsvarende funn ble gjort av professor Hasenfuss' gruppe, ved studier av levosimendan i snitt fra ventrikkelmuskelen hos personer som hadde dødd av hjertesvikt 7.

Til slutt er vi fremme ved sikkerheten ved levosimendan. Når vi ville undersøke substansens virkning på mortaliteten, tok vi som modell for hjertesvikt rotter med legede myokardinfarkter. Vi ligerte en koronærarterie, og rottene fikk lege skaden i sju dager. Deretter fikk de levosimendan i drikkevannet i opptil 312 dager. Levosimendan førte til en signifikant reduksjon av mortaliteten 8. Kontrollsubstansen enalapril hadde også effekt, mens milrinon ikke hadde noen effekt.

Disse undersøkelsene gav oss et fast grunnlag for fortsatt utvikling av levosimendan.


Referanser

1. Calcium sensitizers: What have we learned over the last 25 years? Pollesello P, Papp Z, Papp JG. Int J Cardiol. 2016 Jan 15;203:543-8.

2. Calcium regulation of muscle contraction: the molecular regulation mechanisms of contractility. Rüegg JC. Naturwissenschaften 1987;74:579-84.

3. Cardiac troponin C as a target protein for a novel calcium sensitizing drug, levosimendan. Haikala H, Kaivola J, Nissinen E, Wall P, Levijoki J, Linden IB. J Mol Cell Cardiol 1995;27:9 1859-66.

4. Binding of a new Ca2+ sensitizer, levosimendan, to recombinant human cardiac troponin C. A molecular modelling, fluorescence probe, and proton nuclear magnetic resonance study. Pollesello P, Ovaska M, Kaivola J, Tilgmann C, Lundstrom K, Kalkkinen N, Ulmanen I, Nissinen E, Taskinen J. J Biol Chem 1994;269:28584-90.

5. Mechanisms of action of calcium-sensitizing drugs. Haikala H, Linden IB. J Cardiovasc Pharmacol 1995;26(Suppl 1):510-9.

6. The effects of levosimendan on [Ca2+] in guinea-pig isolated ventricular myocytes. Lancaster MK, Cook SJ. Eur J Pharmacol 1997;339:97-100.

7. Influence of the novel inotropic agent levosimendan on isometric tension and calcium cycling in failing human myocardium. Hasenfuss G, Pieske B, Castell M, Kretschmann B, Maier LS, Just H. Circulation 1998;98:2141-7.

8. Improved survival with simendan after experimental myocardial infarction in rats. Levijoki J, Pollesello P, Kaheinen P, Haikala H. Eur J Pharmacol 2001;419:243-8.


Preparatomtale
Felleskatalogtekst


Sikkerhetsinformasjon SIMDAX®
(preparatomtale, 07.11.2016, pkt. 4.4 og 4.8):

Hypotensjon er en svært vanlige bivirkning.
Alvorlig hypovolemi bør korrigeres før infusjon av levosimendan. Hvis uttalte endringer i blodtrykk eller hjerterytme er observert bør infusjonshastigheten bli redusert eller infusjonen avbrytes.Forsiktighet utvises hos pasienter med lav baseline systolisk eller diastolisk blodtrykk eller hos de med risiko for hypotensjonsepisode. Leger skal skreddersy dosen og behandlingens varighet basert på pasientens tilstand og respons.